信帆生物主營產(chǎn)品: 質(zhì)控品，干擾物質(zhì)，抗體抗原，elisa試劑盒，動物血制品，生化試劑盒等。實驗代做服務(wù)：HE染色/特殊染色/技術(shù)服務(wù)、免疫組化實驗服務(wù)、Western blotting實驗服務(wù)、RT-PCR實驗技術(shù)服務(wù),QPCR(熒光定量PCR）、酶聯(lián)免疫ELISA、生化測試、液相氣相檢測等
產(chǎn)品名稱：）
貨號：XJC5230
規(guī)格：50T
儲存條件：2-8℃
有效期：6個月
產(chǎn)品簡介
非血紅素鐵檢測試劑盒與總鐵測定方法相似，但樣品須經(jīng)酸和熱處理，經(jīng)離心后非血紅素鐵釋放到上清液中，而含血紅素鐵的蛋白則留在沉淀中。其測定原理是動物組織或細(xì)胞經(jīng)組織消化液在酸性加熱條件處理后，經(jīng)離心可分離出血紅素鐵和非血紅素鐵，非血紅素鐵再被還原劑還原為二價鐵后與紅菲咯啉生成紅色化合物，在 500~550nm 有強吸收，可通過酶標(biāo)儀或分光光度計測定。該試劑僅用于科研領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途。
產(chǎn)品組成
編號 | 名稱編號 | 規(guī)格 | Storage（保存） |
1 | 鐵標(biāo)準(zhǔn)儲液 (100μg/ml) | 2ml | 4℃ |
2 | 菲啰啉溶液 | 30ml | 4℃避光 |
3 | TGA 溶液 | 30ml | 4℃避光 |
4 | 乙酸鈉溶液 | 50ml | 室溫（RT） |
5 | 組織樣本消化液 | 自備 | - |
6 | 使用說明書 | 1 份 | - |
自備材料
1、蒸餾水或 PBS、分光光度計、比色皿、恒溫箱或水浴鍋、三氯乙酸、鹽酸
2、精密天平、離心管、剪刀、震蕩器或搖床、離心機、試管、勻漿器
樣本處理
A.組織樣本處理
1、1.5ml 離心管稱重，稱取 100mg 左右的組織放入已稱重的離心管中，再次稱重，兩次相減得到組織凈重。
2、組織消化液的制備：用10g三氯乙酸直接加入100ml 0.4mol/L 鹽酸溶液，混勻后轉(zhuǎn)入棕色試劑瓶，室溫避光待用。
如果沒有0.4mol/L鹽酸溶液，也可以用濃鹽酸。在干凈的燒杯中先加約 60–70 mL 蒸餾水，然后加入 10g三氯乙酸，輕輕搖晃 / 攪拌至完全溶解。用移液管緩慢加入3.3ml 37%濃鹽酸（注意放熱、酸霧）。 加蒸餾水定容到 100 mL，顛倒混勻。轉(zhuǎn)入棕色試劑瓶，室溫避光保存。
向離心管中加入 1ml 以上組織消化液，65℃消化不少于 20h，期間用震蕩器震蕩 3~5 次，每次不少于10min，確保組織完全消化；消化完成后用組織消化液定容至 1.5ml，10000rpm 離心 5min，將管壁及蓋子上的液體取下，取上清液轉(zhuǎn)移至新離心管，混合備用。
B.細(xì)胞樣品處理
培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)消化后計數(shù)（濃度調(diào)整為 0.5 ~ 1×10?/ml），加入等體積的蒸餾水或 PBS 勻漿；勻漿液與組織消化液按 1:5 比例混合，90℃消化 30min，確保細(xì)胞完全消化；冷卻后 10000rpm 離心 5min，將管壁及蓋子上的液體取下，取上清液轉(zhuǎn)移至新離心管，備用。
操作步驟（僅供參考）
1、配制鐵顯色工作液
將菲啰啉溶液、TGA 溶液、乙酸鈉溶液按照3:3:5的體積比混合，配制成鐵顯色工作液，該溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。
2、配制系列鐵標(biāo)準(zhǔn)液
先將鐵標(biāo)準(zhǔn)儲液 (100μg/ml) 用蒸餾水稀釋至 20μg/ml，再按如下表格梯度稀釋，配制不同濃度的鐵標(biāo)準(zhǔn)液：
名稱 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
鐵標(biāo)準(zhǔn)儲液 (20μg/ml) | 0.1 | 0.25 | 0.5 | 0.75 | 1 |
蒸餾水 | 0.9 | 0.75 | 0.5 | 0.25 | 0 |
相當(dāng)于鐵濃度 (μg/ml) | 2 | 5 | 10 | 15 | 20 |
3、加樣操作
取無鐵的干凈比色管，設(shè)置空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測定管，按如下表格依次加液，避免產(chǎn)生氣泡；若樣品鐵含量過高，可減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后測定，樣品檢測建議設(shè)置 2 個平行管，最終結(jié)果取平均值。
名稱 | 空白管1 | 空白管 2 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 測定管 |
蒸餾水 | 0.1ml | - | - | - |
組織消化液 | - | 0.1ml | - | - |
鐵標(biāo)準(zhǔn)液(1-5號) | - | - | 0.1ml | - |
待測樣品 | - | - | - | 0.1ml |
鐵顯色工作液 | 2ml | 2ml | 2ml | 2ml |
4、吸光度測定
加液完成后充分混勻，室溫顯色 10min；以空白管 1 調(diào)零，用分光光度計在 535nm 波長處，分別測定空白管 2、系列標(biāo)準(zhǔn)管、測定管的吸光度，記為空白、標(biāo)準(zhǔn)、測定。
注意：比色皿使用前用待測液潤洗2-3次，避免交叉；檢測時比色皿透光面需擦拭干凈，避免指紋、污漬影響讀數(shù)；每個樣品/標(biāo)準(zhǔn)管測3次，取平均值。
5.結(jié)果計算
以系列鐵標(biāo)準(zhǔn)液的濃度（2、5、10、15、20μg/ml）為橫坐標(biāo)，對應(yīng)吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并求得回歸方程，將測定管吸光度代入方程，計算樣品消化液中的鐵濃度；也可省略標(biāo)準(zhǔn)梯度，直接采用單標(biāo)準(zhǔn)比色測定，推薦選擇 5μg/ml 或 10μg/ml 的鐵標(biāo)準(zhǔn)液。
注意事項
1、操作所用器械、槍頭、容器、比色皿等，需保證干燥、潔凈，嚴(yán)格避免鐵。
2、組織中非血紅素鐵含量差異較小，需對每個組織樣本和離心管單獨稱重，國產(chǎn)離心管重量偏差較大，需重點注意。
3、試劑盒過期驗證：取 10μl 鐵標(biāo)準(zhǔn)儲液 (100μg/ml)，加入 200μl 鐵顯色工作液，若溶液顯深紅色，說明試劑未過期，可繼續(xù)使用。
4、試劑有效性判讀：以空白管 1 為對照調(diào)零后，若空白，說明無鐵，試劑可使用；若空白，說明組織消化液存在鐵。
5.組織消化液配制時候，如果用到濃鹽酸，請務(wù)必按照規(guī)定小心操作。
6.試劑產(chǎn)品含有酸性溶液及有一定腐蝕性，請在實驗操作中務(wù)必穿戴好實驗服，帶好防護面罩和實驗手套等，做好實驗防護，嚴(yán)禁直接接觸試劑。試劑開封后，請盡快使用，以免影響后續(xù)實驗結(jié)果。
使用安全措施：請務(wù)必穿戴好實驗服、防護面罩和實驗手套等，做好實驗防護。
嚴(yán)禁直接接觸產(chǎn)品。剩余產(chǎn)品請勿隨意丟棄，
請按照實驗室相關(guān)生物和化學(xué)廢棄物的處理規(guī)定，進行處理。
在線咨詢